北京化工大学朱玉山课题组在Nature子刊发表文章《Computational loop reconstruction based design of efficient PET hydrolases》。本研究通过对 PET 水解酶关键环区（β6–β7 loop）进行主链结构重构，引入 H218N/F222M 双点突变，显著提升了酶的热稳定性与催化活性，并成功将该设计策略推广至多种工程化 PET 水解酶体系。在高底物浓度和低酶用量条件下，多个重构突变体均表现出优于现有基准酶的 PET 解聚效率，且在进一步降低酶用量时仍保持较高转化率。该工作表明，基于环区主链重构的理性设计是一种提升 PET 水解酶性能的有效通用策略，为酶促 PET 解聚的工业化应用和塑料循环经济的实现提供了重要支撑。
酶促 PET 解聚被认为是实现 PET 塑料循环经济的绿色且可持续途径之一，其在温和条件下实现高选择性解聚的优势，使其在塑料废弃物回收领域具有重要应用前景。然而，受限于酶对高结晶度、高分子量 PET 的催化效率不足，尤其是在工业相关的高底物负载和低酶用量条件下，现有 PET 水解酶的活性仍难以满足实际应用需求。因此，如何在保持甚至提升热稳定性的同时，进一步提高酶在真实工况下的催化效率，是当前 PET 生物降解领域面临的核心挑战。
图1 无定形 PET 聚合物的结构特征、PET 水解酶的催化机制及其重设计的计算模型。
针对上述问题，本研究跳出传统“侧链微调”的工程化思路，从反应本质出发，以 PET 水解反应的限速步骤——酰化过程中形成的四面体中间体为设计对象，构建了基于过渡态构象的底物–酶复合模型。通过引入反映 PET 聚合物真实构象特征的三单元底物模型，并结合量子力学/分子力学（QM/MM）结果，对酶–底物界面的空间匹配性进行系统评估，从而为后续结构重构提供了明确的理论依据。
图2 PET 水解酶 Bhr-PETase 的计算重设计及所设计突变体的实验表征。
计算分析表明，在高热稳定性 PET 水解酶 Bhr-PETase 中，β6–β7 loop 区域的主链构象与 PET 聚合物在过渡态构象下存在显著的空间排斥，成为限制底物有效结合和反应推进的关键结构瓶颈。进一步研究发现，该排斥主要源于 loop 主链本身的位置，而非单一侧链取向，这意味着常规的点突变策略难以从根本上解决该问题，必须在主链层面进行结构重构。
图3 基于计算的环区重构引导的 PET 水解酶 Bhr-PETase 重设计及所设计突变体的实验表征。
基于此，本研究对 β6–β7 loop 的主链构象进行了系统重建，生成多种候选 loop 构型，并通过能量评估与分子动力学模拟筛选出既能显著降低与 PET 的空间冲突、又可维持整体折叠稳定性的最优构象。在此基础上，通过精确计算设计引入 H218N 和 F222M 双点突变，对 loop 区域的氢键网络与疏水堆积进行协同优化，最终获得了具有良好结构稳定性和底物适配性的突变体 Bhr-NMT。
图4 在工业条件下对高活性突变体 Bhr-NMT 的实验表征。
实验结果表明，Bhr-NMT 在保持高热稳定性的同时（Tm = 92.9 °C），其催化活性较野生型显著提高 87%。更重要的是，将该 β6–β7 loop 重构策略成功移植至其他工程化 PET 水解酶 LCC-ICCG 和 Kubu-PM12 中，分别获得 LCC-ICCG-NM 和 Kubu-PM12-NM 突变体，显示出该设计策略良好的通用性。在高底物浓度（165 g kg⁻¹）和低酶用量条件下，三种突变体的整体转化率均显著优于各自基准酶。
图5 将环区重构突变移植以构建高活性 PET 水解酶 LCC-ICCG-NM 和 Kubu-PM12-NM 及其在工业条件下的实验表征。
总体而言，该研究通过过渡态导向的 loop 主链重构，突破了传统点突变工程的局限，揭示了酶–聚合物底物界面中主链构象匹配性对催化效率的决定性作用。该工作不仅为高效 PET 水解酶的理性设计提供了可复制的范式，也为其他高分子底物相关酶的工程化改造提供了重要启示，展示了生物催化在工业塑料回收与循环经济体系中的巨大应用潜力。
图6 高活性突变体 Bhr-NMT 的结构解析。
文章计算设计方法：
本文以Bhr-PETase晶体结构（PDB ID:7EOA）为模板，基于无定形PET的结构特征（如关键键的扭转角范围）构建含三个PET单体的模型底物，利用实验室开发的计算酶设计工具 PRODA 优化酶的结合口袋。采用Modeler工具对 β6-β7 环（L187-T195）进行重塑，生成50种不同构象，通过DOPE评分和分子动力学（MD）模拟筛选出最优构象Loop10。进行高通量MD模拟（10×1 ns或5×5 ns），基于结合能、范德华排斥力、亲核攻击距离、氢键稳定性等四个催化指标筛选候选序列，排除假阳性结果。
图片：汪宏钊
文案：汪宏钊
审核：贾广联 王兴 曹辉